數(shù)字PCR技術(shù)服務(wù)
數(shù)字 PCR 的特征
1. 稀有變異檢測（Rare variant detection）
從外周血內(nèi)獲得分子生物標記物、進行特異突變篩查、監(jiān)測病程是醫(yī)療保健的一個發(fā)展
方向。這要求檢測體系(探針和引物)必須保證能在高背景野生型等位基因存在的條件下檢測
到低豐度的突變基因。由于數(shù)字PCR 降低了對反應(yīng)擴增效率的要求，采取終點法判讀的方
法，數(shù)字PCR 可以很好的勝任稀有變異檢測的工作，同時也減少了引物設(shè)計過程中由于擴
增效率不合要求而造成的浪費(時間、樣品、耗材等等)。
2. 拷貝數(shù)變異（Copy-number variation）
雖然生殖系或體細胞拷貝數(shù)變化是否具有臨床意義需要取決于具體臨床情況，但 CNV
改變基因表達水平卻有十分重要的臨床意義。數(shù)字PCR 具有準確性和精確性的特點，這使得其可以在CNV 研究中發(fā)揮重要的作用。在有已知拷貝數(shù)的內(nèi)參基因的前提下，數(shù)字PCR
不但可以清晰區(qū)分一個或者兩個拷貝，更可以對多拷貝基因進行分析，例如，五個或者六個
拷貝。在這一點上，相比于包括qPCR 在內(nèi)的常規(guī)方法，數(shù)字PCR 優(yōu)勢明顯。
3 樣本需求量低（Minimal template requirements）
數(shù)字 PCR 的一個主要優(yōu)勢是所需樣本量很低，這對于一些臨床樣本來說特別重要，尤
其是樣本珍貴或者樣本核酸存在降解的情況下。目前很多基因組研究方法，例如CGH 芯片、
二代測序等，在實驗之前都需要對有限的臨床樣本進行擴增以保證達到實驗樣本量的要求。
然而，實際情況是，預擴增會引入偏向（bias），無法保證不改變樣本內(nèi)待測基因的相對豐
度，對實驗結(jié)果影響的嚴重程度取決于不同的應(yīng)用。
數(shù)字 PCR 樣本需求量低的特性可以避免由于預擴增所引入的實驗誤差，更好的實現(xiàn)實
驗的精準性和可靠性。
4 分析便捷（Ease of Analysis）
數(shù)字 PCR 有或無的結(jié)果判讀非常簡潔。對于相對定量分析來說，只需使用泊松原理將
陰性/陽性微滴的比例轉(zhuǎn)換成表達豐度、使用一個或多個內(nèi)參基因進行均一化后即可完成分
析。
5 與二代測序整合（Integration with next generation sequencing protocols）
如何在臨床領(lǐng)域發(fā)揮 NGS 的巨大優(yōu)勢是一個重要的問題。數(shù)字PCR 是一項非常有用
的互補型技術(shù)。例如：使用數(shù)字PCR 檢測患者特異性標記物，與腫瘤配對末端測序?qū)嶒灲Y(jié)
果進行相互驗證，并且可以進行NGS 文庫的制備和定量。
目前很難確認什么樣的 NGS 結(jié)果是臨床所需要的，通常來說NGS 篩選到的變異或異常還需要使用經(jīng)典的Sanger 測序進行驗證。數(shù)字PCR 的出現(xiàn)，可以為NGS 發(fā)現(xiàn)的突變進
行有效驗證提供一個非常好的實驗思路與平臺。
1. 突變/稀有變異檢測（Mutation/rare variant detection）
隨著伊馬替尼（imatinib）在bcr-abl 陽性的慢性粒細胞白血病上的成功應(yīng)用，越來越多
的科學家將研究重點轉(zhuǎn)移至生物標記物的開發(fā)及基于特異基因的靶向治療。數(shù)字PCR 已經(jīng)
成功的應(yīng)用于腫瘤組織內(nèi)的EGFR 檢測以及EGFR 突變頻率的分析。
是否能夠開發(fā)出有效的靶向治療藥物，與突變基因的檢測密切相關(guān)。其中（1）攜帶藥
物作用突變位點的癌細胞百分比；（2）突變的特定等位基因是否可以被準確檢測到，這兩
點都直接影響到靶向治療是否有效。很顯然，在腫瘤均質(zhì)細胞內(nèi)檢測單一突變相對簡單，但
是如果在異質(zhì)組織內(nèi)，在僅存有少量突變存在的情況下，如何準確檢測出突變/稀有變異，
或者針對于同一種癌癥中多種亞克隆的準確鑒定，對個性化醫(yī)療的發(fā)展是一個巨大的挑戰(zhàn)。
最近的一項研究表明，數(shù)字PCR 在進行突變/稀有變異檢測中發(fā)揮著重要的作用。使用
NGS 對于肝癌的一個抑癌基因進行篩查，30 倍覆蓋全基因組篩查并沒有檢測到該基因，但
76 倍覆蓋的成對外顯子篩查卻可以檢測到。后續(xù)使用傳統(tǒng)毛細管測序進行驗證，結(jié)果也不
能確認。然而使用數(shù)字PCR 可以輕松的檢測到該突變，而且精準的確認該突變的突變頻率
為13.2%。因此，對于突變等位基因的研究來說，研究平臺的靈敏度和準確性是未來的研
究開發(fā)焦點所在。
數(shù)字 PCR 的另外一個潛在的重要應(yīng)用是通過檢測患者外周血樣對進入外周循環(huán)的的腫
瘤組織核酸進行分析。數(shù)字PCR 技術(shù)可以直接忽略預擴增的環(huán)節(jié)直接進行準確的定量分析，
相比于傳統(tǒng)的PCR 檢測方法，有更高的靈敏度。而且更令人鼓舞的是，有實驗證據(jù)證明，
微滴式數(shù)字PCR 可以實現(xiàn)1:100,000 的突變頻率篩查。
同樣的，在無創(chuàng)產(chǎn)前篩查領(lǐng)域，也已經(jīng)有研究證明可以通過數(shù)字PCR 的方法可以對游
離在孕婦外周血內(nèi)的胎兒DNA 進行準確分析，用來檢測嬰兒的21 號染色體三體。這表明，
在未來數(shù)字PCR 可能會取代NGS 實現(xiàn)臨床21 三體的無創(chuàng)篩查。
在轉(zhuǎn)化移植領(lǐng)域，數(shù)字 PCR 也發(fā)揮著重要的作用，有數(shù)據(jù)證明，數(shù)字PCR 可以在心
臟移植受體患者外周血內(nèi)檢測到供體特異DNA。這對移植后排異反應(yīng)的跟蹤和預估提供了
很好的科研證據(jù)。
總的來說，數(shù)字 PCR 雖然不能發(fā)現(xiàn)新的生物標志物，但卻是對于臨床樣本生物標志物
定量分析的不二之選。
2. 藥理學（Pharmacogenetics）
有研究表明，不但體細胞變異會影響治療藥物的選擇，生殖細胞特定基因的變異對特定
處方的選擇也會有直接的影響。有一些點突變或者SNP 位點可能會影響藥物代謝；還有一
些情況下一些特異位點的CNV 可以預測藥物對個體的療效。在未來，通過數(shù)字PCR 技術(shù)，
我們可以獲得更多關(guān)于生殖細胞CNV 對藥理學影響的實驗證據(jù)。
3. 基因表達分析（Gene expression analysis）
除了常規(guī)的基因表達分析以外，數(shù)字 PCR 特別適用于單細胞或少量細胞的基因表達譜
分析，這是對臨床生物標志物篩選和鑒定的很好探索。最近，有一些科學家開始著眼于非編
碼RNA（non-coding RNA, ncRNA），尤其是其中的亞類-microRNAs。從原理上來講，使
用數(shù)字PCR 進行microRNA 的分析更為可行，同時，在ncRNA 的篩選和鑒定領(lǐng)域，數(shù)字
PCR 也可以與NGS 互為補充，互為印證，推動這一領(lǐng)域的發(fā)展。
數(shù)字PCR 與二代測序(NGS)/全基因組測序的關(guān)系
在過去的三年內(nèi)，二代測序技術(shù)飛速發(fā)展，NGS 的巨大數(shù)據(jù)信息和并行樣本處理能力
可以用來進行CNV 的預測。數(shù)字PCR 是一個很好的平臺，可以與NGS 平臺獲得的數(shù)據(jù)進
行相互印證。數(shù)字PCR 平臺可以進行精準的絕對定量分析，極佳的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性，而且樣本
需求極低。而且，數(shù)字PCR 的平臺可以很好的整合真?zhèn)�實驗流程，實現(xiàn)目標測序、個體生
物標志物開發(fā)、化療后外周血檢測的完整研究路線。
總之，數(shù)字PCR 是一個全新的絕對定量方式，整合了目前成熟發(fā)展的數(shù)字PCR 技術(shù)，
帶來了前所未有的精確性和靈敏度，開啟了一場核酸定量技術(shù)的革命。在未來，數(shù)字PCR
在分子診斷領(lǐng)域會發(fā)揮更大的作用，對于臨床診斷領(lǐng)域分子生物標志物的篩選及驗證發(fā)展會
有巨大的促進。
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