上海迪奧提供非放射性的雜交服務(wù).
Southern Blotting服務(wù)
用于檢測(cè)重組DNA，也可分析DNA樣品中是否有與探針序列同源的DNA片段。用于基因診斷，也可驗(yàn)證檢測(cè)片段的分子量大小。將基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切，進(jìn)行瓊脂糖電泳，把分離后定位在凝膠上的不同分子量的DNA經(jīng)堿變性處理，將凝膠中變性的DNA轉(zhuǎn)移至一固相支持濾膜。利用標(biāo)記的某一DNA、RNA或寡核苷酸與固著于濾膜上的DNA發(fā)生同源性雜交，利用放射自顯影（化學(xué)發(fā)光法或顯色法）檢測(cè)。
（一） 器材：臺(tái)式離心機(jī)，恒溫水浴鍋，電泳儀，水平電泳槽，雜交爐，雜交袋，尼龍膜或硝酸纖維素膜，轉(zhuǎn)印跡裝置，濾紙，吸水紙，紫外交聯(lián)儀或80℃烤箱，搖床，X線膠片。
（二） 試劑：限制性內(nèi)切酶，DNA加樣緩沖液，DNA Ladder Marker，0.25M HCl，變性液（0.5M NaOH，1.5M NaCl），中和液（0.5M Tris- HCl PH7.5，3M NaCl）, 轉(zhuǎn)印跡液20╳SSC（3M NaCl，0.3M檸檬酸鈉，PH7.0），標(biāo)記探針， 2╳SSC，預(yù)雜交液和雜交液，2×洗液（2×SSC,0.1%SDS）,0.5×洗液(0.5×SSC,0.1%SDS),1×緩沖洗液（0.1M馬來酸，0.15M NaCl ,PH7.5,0.3%Tween20）,1×封阻液[1％(W/V)封阻劑溶于1×馬來酸溶液（0.1M馬來酸，0.15M NaCl ,PH7.5）]，1×檢測(cè)液（0.1M Tris- HCl,0.1M NaCl,PH7.5），抗－地高辛－堿性磷酸酶。
（三） 步驟：
1、 酶切（以單一酶切為例），設(shè)置反應(yīng)體系（反應(yīng)體系30μl）
ddH2O 5μl
基因組DNA（0.5μg/μl） 20μl
10╳緩沖液 3μl
內(nèi)切酶（10U/μl） 2μl
短暫離心，消除離心管內(nèi)氣泡，于37℃消化過夜；
注意：若基因組DNA過低，要以較大體積進(jìn)行限制酶消化，消化完畢后，可以通過乙醇沉淀、濃縮DNA片段，加少量DNA加樣緩沖液點(diǎn)樣。
2、 消化好的樣品點(diǎn)樣于0.7％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳；
注意：為保證DNA均勻分散于加樣孔，應(yīng)緩慢將樣品加至加樣孔。
3、 電泳結(jié)束后，將凝膠依次用如下試劑處理進(jìn)行堿變性，室溫下輕輕搖動(dòng)確保溶液覆蓋凝膠
0.25M HCl 10－15 min
蒸餾水搖洗 5 min
變性液 40 min
蒸餾水搖洗 5 min
中和液 15 min，2次；
4、 在凝膠堿變性的同時(shí)，制備轉(zhuǎn)印跡裝置。Southern blot轉(zhuǎn)膜技術(shù)有三種：
1），毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法；
2），電轉(zhuǎn)移法；
3），真空轉(zhuǎn)移法。
這里介紹最經(jīng)典的毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法（向上轉(zhuǎn)移），在轉(zhuǎn)印跡槽中，倒入20╳SSC溶液，槽中置一固相支持物，在固相支持物上從下向上依次置入：兩張與凝膠等寬的濾紙，將濾紙縱向自固相支持物垂于轉(zhuǎn)印跡槽中（簡(jiǎn)稱“橋”），底面在上的凝膠，濾膜（與凝膠等大），濾紙（與凝膠等大），吸水紙（略小于濾紙，5－8cm高），400－800g重物。凝膠四周用Parafilm膜包圍防止短路。濾膜事先用2╳SSC浸濕至少5 min。濾紙事先用20╳SSC浸濕。轉(zhuǎn)膜4－18小時(shí)；
注意：轉(zhuǎn)膜裝置中各層濾紙和膜之間要將氣泡趕凈。一旦建立轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)后，要防止濾膜和凝膠錯(cuò)位。防止吸水紙倒塌和完全濕透，要及時(shí)更換吸水紙。
5、 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出濾膜，邊角剪一小角做標(biāo)記。濾膜于2╳SSC搖洗5min，用濾紙吸干；
6、 用紫外交聯(lián)照射（正面朝上）或于80℃烤箱烘烤0.5－2小時(shí)；
7、 膜可立即進(jìn)行預(yù)雜交和雜交，或保存于4℃待以后應(yīng)用；
8、 預(yù)雜交和雜交
1） 將雜交膜浸濕于6╳SSC 2min，同時(shí)預(yù)熱預(yù)雜交液和雜交爐至預(yù)雜交溫度；
2） 雜交膜封于雜交袋，按0.2ml/cm2膜面積加入預(yù)雜交液，預(yù)雜交至少1小時(shí)；
3） 用于southern blot的探針可分為DNA探針、RNA探針和寡核苷酸探針。對(duì)探針的標(biāo)記方法又可以分為放射性標(biāo)記和非放射性標(biāo)記。我們公司主要介紹非放射性地高辛標(biāo)記探針的雜交方法。雜交時(shí)各種探針的用量：DNA探針，5－25ng/ml；RNA探針，100ng/ml；寡核苷酸探針，0.1－10pmol/ml。雙鏈DNA探針提前100℃變性10min后迅速冰浴，單鏈探針無需變性。將處理后的探針加入雜交液溫浴至雜交溫度。雜交溫度的選擇根據(jù)雜交液的不同而不同；
注意：應(yīng)用寡核苷酸探針時(shí)，雜交溫度的選擇。Tm＝4╳(G+C)+2╳(A+T),雜交溫度比Tm低約10℃。
4） 棄去預(yù)雜交液，將含探針的雜交液注入雜交袋，至少3.5ml/10╳1℃m，置入雜交爐滾動(dòng)；
9、 雜交后的洗膜處理過程，順序如下：
2×洗液 2×15min
0.5×洗液 2×15min
1×緩沖洗液 1×3min
1×封阻液 1×60min
抗體液* 1×30min
1×緩沖洗液 2×15min
1×檢測(cè)液 1×5min
* 抗－地高辛－堿性磷酸酶用1×封阻液稀釋10，000倍（若用顯色法稀釋5000倍；若用CDP-Star檢測(cè)用20，000倍稀釋）；
10、將膜浸于CSPD液（CSPD用1×檢測(cè)液稀釋100倍，CDP-Star也用1× 檢測(cè)液稀釋100倍）室溫避光靜置 5min；回收剩余的CSPD液或CDP-Star液避光保存于4℃可反復(fù)應(yīng)用3－5次；
11、將膜上殘液吸凈，用保鮮膜封好于37℃反應(yīng)15min，然后將膜固定于壓片夾，進(jìn)行曝光。
注意：若用顯色劑檢測(cè)，新鮮配置顯色劑（45μlNBT和35μl BCIP溶于10ml 1×檢測(cè)液），將膜浸于顯色劑中避光反應(yīng)4－16小時(shí)，反應(yīng)期間不要移動(dòng)膜。
Nothern blot
用于分析RNA樣品中特定mRNA的大小和豐度。RNA經(jīng)變性瓊脂糖凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)印跡至尼龍膜等固相支持膜上，再與標(biāo)記的特異性探針雜交，從而分析固定于膜上的mRNA的數(shù)量和大小。常用RNA分析方法，有甲醛變性電泳、乙二醛/DMSO變性電泳和狹線印跡雜交三種方法。這里主要介紹甲醛變性電泳方法。
（一） 器材：電泳儀，水平電泳槽，轉(zhuǎn)印跡裝置，尼龍膜或NC膜，濾紙，吸水紙，雜交爐，恒溫水浴鍋，搖床，X線膠片.
（二） 試劑：0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）,10×MOPS電泳緩沖液[0.2M MOPS （PH7.0）,0.05M 乙酸鈉，0.01EDTA （PH8.0）],37%甲醛（PH>4.0），RNA（甲醛）完全上樣緩沖液，0.05M NaOH， 20╳SSC（3M NaCl、0.3M檸檬酸鈉，PH7.0），10╳SSC，標(biāo)記探針，預(yù)雜交液和雜交液，2×洗液（2×SSC,0.1%SDS）,0.5×洗液(0.5×SSC,0.1%SDS),1×緩沖洗液（0.1M馬來酸，0.15M NaCl ,PH7.5,0.3%Tween20）,1×封阻液[1％(W/V)封阻劑溶于1×馬來酸溶液（0.1M馬來酸，0.15M NaCl ,PH7.5）]，1×檢測(cè)液（0.1M Tris- HCl,0.1M NaCl,PH7.5），抗－地高辛－堿性磷酸酶
（三） 步驟：
1、制膠(50ml)：
瓊脂糖 0.75g
DEPC-H2O 35ml
10×MOPS 5.5 ml
甲醛 10ml
EB 2.5μl
將制備好的膠置入電泳槽，加電泳緩沖液1×MOPS 450ml， 100V電壓預(yù)電泳5min；
2、取總RNA(10μg/孔)，加RNA甲醛電泳完全加樣液(按RNA: Loading Dye =1:4)；65℃變性 10min，立即置冰上5min；將樣本點(diǎn)于膠孔中，60V電壓下電泳2-3h；
3、電泳結(jié)束后處理凝膠，DEPC.水沖洗凝膠3次， 0.05 NaOH 浸泡凝膠20min，20╳SSC浸泡凝膠40min；
4、制備轉(zhuǎn)印跡裝置。這里介紹最經(jīng)典的毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法（向上轉(zhuǎn)移），在轉(zhuǎn)印跡槽中，倒入20╳SSC溶液，槽中置一固相支持物，在固相支持物上從下向上依次置入：兩張與凝膠等寬的濾紙，將濾紙縱向自固相支持物垂于轉(zhuǎn)印跡槽中（簡(jiǎn)稱“橋”），底面在上的凝膠，濾膜（與凝膠等大），濾紙（與凝膠等大），吸水紙（略小于濾紙，5－8cm高），400－800g重物。凝膠四周用Parafilm膜包圍防止短路。濾膜事先用10╳SSC浸濕至少5 min。濾紙事先用20╳SSC浸濕。轉(zhuǎn)膜4－18小時(shí)；
注意：甲醛瓊脂糖凝膠質(zhì)地脆弱，小心操作凝膠防止凝膠碎裂。一旦建立轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)后，要防止濾膜和凝膠錯(cuò)位。防止吸水紙倒塌和完全濕透，要及時(shí)更換吸水紙。
5、轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出濾膜，邊角剪一小角做標(biāo)記。濾膜于2╳SSC搖洗5min，用濾紙吸干；
6、用紫外交聯(lián)照射（正面朝上）或于80℃烤箱烘烤0.5－2小時(shí)；
7、膜可立即進(jìn)行預(yù)雜交和雜交，或保存于－80℃待以后應(yīng)用；
8、預(yù)雜交和雜交方法同southern blot,預(yù)雜交和雜交溫度的選擇：DNA探針應(yīng)用50℃，RNA探針應(yīng)用68℃，寡核苷酸探針應(yīng)用溫度同southern blot方法中所述；
9、雜交后膜的處理方法同southern blot。
中文(China)
英文(English)
