de novo基因組測序及分析
de novo測序（也叫從頭測序），是指不用任何參考序列而對某個物種進行測序，用生物信息學方法進行組裝，最終獲得該物種的基因組序列圖譜。
目前，全基因組測序已逐步成為各個物種基礎(chǔ)研究的重要手段之一。通過基于新一代高通量測序技術(shù)的全基因組測序，可以預測重要基因和蛋白以了解其功能和可能機制。在研究病原菌的致病性與疾病的預防和治療方面，可以鑒定致病相關(guān)基因、開發(fā)和研究疫苗、開發(fā)新型抗生素等；在研究細菌進化方面，可以研究種內(nèi)進化關(guān)系；合理利用有益真菌，對控制和預防有害真菌對人類的生產(chǎn)和生活具有重要意義。在大型動植物領(lǐng)域，更是對該物種的進化研究，基因改良育種有重大的作用。
一、技術(shù)路線
de novo測序技術(shù)路線圖
二、技術(shù)指標
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基因組框架圖 |
基因組精細圖 |
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基因組覆蓋率 |
＞90% |
＞95% |
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基因區(qū)覆蓋率 |
＞95% |
＞98% |
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Contig N50 |
＞5 Kb |
＞20 Kb |
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Scaffold N50 |
＞20 Kb |
＞300 Kb |
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單堿基錯誤率 |
＜0.01% |
＜0.01% |
本指標具體根據(jù)所分析的物種可能會有變化，請與當?shù)劁N售代表聯(lián)系
三、 生物信息分析
可結(jié)合客戶的需求，協(xié)商確定定制化信息分析服務(wù)內(nèi)容。
四、 相關(guān)案例
圖a為裝配基因測序深度的分布；圖b為裝配基因與BAC序列的對比
圖a為對齊與不對齊的非重復序列的長度；圖b為將人、熊貓和狗的染色體同線的位于同一條染色體上
五、 常見問題
1. 第二代測序技術(shù)與傳統(tǒng)Sanger測序相比有什么優(yōu)勢？
答：第二代測序技術(shù)的測序通量是傳統(tǒng)Sanger法的上萬倍，并且可以進行長片段雙末端測序，將測序數(shù)據(jù)拼接成較長的Contig和Scaffold。與Scaffold法相比，具有高通量、高靈敏度、高準確性、低成本和耗時短等多個突出優(yōu)勢。如人類基因組測序是六個國家耗資27億多美元歷經(jīng)10年才完成的，而如今利用第二代測序技術(shù)平臺，只需幾個月就可以完成。
2. 測序的實驗周期是多久？
答：根據(jù)具體基因組大小和復雜程度來確定完成時間，一般地從獲得樣品到高通量測序完成，細菌等小基因組需要1-2個月，其他基因組需要2-6個月。
3. DNA樣品的送樣要求如何？
答：DNA樣品總量不小于10µg，濃度≥200ng/µL，OD值在1.8-2.0之間，樣品濃度越高越好。請?zhí)顚懲暾乃蜆佑唵�，用自封袋密封后隨同樣品一起附干冰送樣。
4. 是否需要生物學重復？重復幾次？
答：是的，至少需要兩次生物學重復，3次以上的生物學重復更好。2011年7月Hansen發(fā)表的文章表明生物學差異是基因自身表達的特性，與檢測技術(shù)的選擇以及數(shù)據(jù)處理的方式無關(guān)。如果不設(shè)生物學重復，高影響因子的雜志可能會因此而拒稿。把這篇文章列在參考文獻里吧
5. 如何檢測基因組組裝的準確性？
答：目前，主要可以通過以下幾種方法來檢驗基因組組裝的準確性。（1） 通過構(gòu)建BAC或Fosmid文庫，并進行常規(guī)測序，將所得序列與拼接好的Contigs作比對以判斷基因組組裝的準確率。（2）將已知的基因序列與拼接好的Scaffold作比對，查看兩者是否吻合，吻合度越高，表明基因組組裝越好。而且已知的基因序列越多，評價結(jié)果越可靠。（3）估計組裝后基因組的單堿基準確度，利用新一代測序技術(shù)，如果95%以上的基因組單堿基覆蓋度超過20×，則認為該見機組的單堿基準確度較高。
6. 如何避免基因組中的重復序列造成的組裝錯誤？
答：應(yīng)用新一代高通量測序技術(shù)，構(gòu)建200bp、500 bp、2 Kb、6 Kb、10 Kb、20 Kb等不同大小的DNA測序文庫，進行雙末端海量測序，可以避免基因組中的重復序列造成的錯拼。當測序數(shù)據(jù)量達到基因組大小的60倍以上時，即可保證基因組的完整性和序列中單堿基的準確性。
六、 相關(guān)文獻
1. Li R, Fan W, Tian G, Zhu H, et al The sequence and de novo assembly of the giant panda genome. Nature 2010 Jan 21; 463:311-17. Epub 2009 Dec 13
2. Genome Sequence of Staphylococcus capitis QN1, Which Causes Infective Endocarditis. J. Bacteriol. 2012, 194(16):4469. DOI: 10.1128/JB.00827-12.
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